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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004
Facultad de Ciencia y Tecnología
(C5-C12) y P. aeruginosa (C12-C17); sin embargo, no se ha reportado ninguna cepa de este género con capacidad para degradar n-alcanos sólidos (Singer y Finnerty, 1984).
Pseudomonas aeruginosa MGP-1 fue aislada a partir de suelos contaminados con hidrocarburos en el Laboratorio de Microbiología General de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, como parte de un proyecto denominado “Liberación de micro- organismos al medio ambiente”.
Objetivo
Determinar la capacidad de Pseudomonas aeruginosa para utilizar alcanos sólidos (parafinas) como única fuente de carbono y energía, así como los porcentajes de degradación de las parafinas.
Metodología
Utilización de mezclas de parafina como fuente de carbono y energía. Se determinó la utilización de mezclas de parafinas con diferentes temperaturas de fusión denominadas como PI (pf 56 - 61 oC), PII (pf 65 oC), PIII (pf 73-80 oC) y PIV (pf 59-63 oC), marca Aldrich. El medio mineral M9 se utilizó en todos los experimentos y se preparó con 6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0.5 g/l de NaCl, 2.0 g/l de NH4Cl, y se esterilizó a 121 oC durante 15 min y posteriormente se le adicionaron 2.0 ml/l de una solución de MgSO4.7H2O, a una concentración 1M y 100 μl/l de CaCl2 1M. Las cinéticas de crecimiento individuales para cada mezcla de parafina se hicieron en matraces con 50 ml del medio mineral M9; 1% de las mezclas de parafinas y 500 μl de un inóculo de la cepa. Los cultivos se incuba- ron a 27 oC y en agitación de 100 rpm. El crecimiento se midió determinando el número de UFC/ml por cuenta viable en agar cuenta estándar.
Cinética de crecimiento. Las cinéticas de cre- cimiento se hicieron individualmente, P. aeruginosa MGP-1 fue cultivada en mezcla de parafinas en las condiciones mencionadas. Se hicieron dos cinéticas de crecimiento por triplicado. Los cultivos fueron incubados a 27 oC ± 2 oC con agitación de 100 rpm. Los testigos negativos para crecimiento y degradación no fueron inoculados, e igualmente se montó un testigo sin fuente de carbono.
La degradación de las mezclas se hizo en lote y por duplicado. Antes de que los cultivos llegaran a la fases estacionaria, se les extrajo la fase orgánica tres veces con benceno.
Las fases orgánicas fueron recolectadas en matraces y deshidratadas pasándolas a través de un papel filtro Wathman del n. 1 con Na2SO4. Se concentraron las muestras por destilación con un rotovapor, para efectuar el análisis cromatográfico.
Análisis cromatográfico. Para analizar las fases or- gánicas residuales, se utilizó un cromatógrafo de ga- ses Perkin Elmer AutoSystem XL con detector de ionización de flama; se utilizó una columna Perkin Elmer-5 de sílica fundida, 5% fenil, metilpolisiloxano, con 30 m de longitud, 0.53 mm de diámetro interno y 0.5 μ de película. Se utilizó nitrógeno como gas acarreador a 10 psi. La temperatura del inyector se mantuvo a 310 °C ; se inyectó 1 μl. La temperatura inicial del horno fue de 55 °C durante 5 min, pos- teriormente, se elevó a 280 °C y así se mantuvo du- rante 5 min y, finalmente, la temperatura se aumentó gradualmente 3 °C/ min hasta alcanzar los 310 °C. La temperatura del detector se mantuvo a 310 °C. El tiempo de corrida fue de 75 min. Las parafinas resi- duales se cuantificaron a los 16 días; los porcentajes de degradación se determinaron considerando el área obtenida de la parafina residual del cultivo sin ino- cular como el 100% y el área de la parafina residual del cultivo.
Resultados
Utilización y degradación de mezclas de pa- rafinas por P. aeruginosa MGP-1. La Figura 1 muestra la cinética de crecimiento de P. aeuginosa MGP-1 sobre cada una de las mezclas de parafinas, en log de las UFC/ml. La cepa creció más rápido sobre la PI; en la PII el crecimiento fue más lento, el cre- cimiento que se obtuvo en la cepa cultivada en la PIV fue semejante a la de PI.
La Figura 2 presenta la gráfica de los porcentajes de degradación para cada mezcla de parafinas, respecto al tipo de mezcla de parafina que se utilizó. El por- centaje de degradación fue mayor en la PI, seguida de PIV, y el menor, en PII. En los tres casos, la degra- dación de las parafinas fue proporcional al creci- miento de la cepa.