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Facultad de Ciencia y Tecnología
La activación del sistema de la proFO se presenta gracias a la transformación de esta proteína a Fenoloxidasa (FO), dicho proceso se da por hidrólisis, mediada por una proteasa de tipo serina que recibe el nombre de enzima activadora de la proFO (EAproFO). Esta reacción se inicia gracias a la unión de los componentes estructurales de la membrana de agentes micóticos y bacterianos, como los lipopoli- sacáridos (LPS) y ß-1-3 glucanos (Laminarina), a un receptor de membrana. Una vez activada la FO, comienzan las reacciones de reducción de óxido que permiten que los difenoles se transformen en qui- nonas, moléculas precursoras de la melanización.
El conocimiento actual del sistema inmune de los hexápodos deriva en su mayoría de los estudios genéticos y moleculares en Drosophila (Zdobnov et al., 2002). Sin embargo, al comparar otros organismos, como el mosquito Anopheles, que responde a las infecciones por Plasmodium, encontraron que los genes en A. gambiae están asociados con la inmunidad del insecto, y se demostró que ellos divergen amplia- mente de los de Drosophila (Christophides et al., 2002). Buenos ejemplos son las enzimas proFO (nueve en el mosquito, tres en la mosca de la fruta); ya que estas enzimas catalizan la síntesis de melanina, la cual está asociada con varias reacciones de defensa entre los insectos.
García Gil et al. (2002) realizaron un estudio sobre el efecto de los inhibidores de la síntesis de prosta- glandinas sobre la coagulación en el homóptero Dactylopius coccus (cochinilla del nopal).
Aedes aegypti es un díptero de la familia Culicidae, y la importancia de su estudio radica en que es un vector de enfermedades como el dengue, la fiebre amarilla y varios virus, entre ellos, el transmisor de la encefalitis. Por tal motivo, el conocimiento del sistema inmunológico de esta especie permitiría crear estrategias para el control biológico, por ejemplo, mediante una inmunodepresión específica para dicho organismo (Söderhäll e Iwanaga, 1996).
Las hembras representan el factor de riesgo dentro de este género, por ser hematófagas, hábito que las hace susceptibles a adquirir el arbovirus (den- gue o fiebre amarilla) (Söderhäll e Iwanaga, 1996). El estudio de los hexápodos vectores cobra mayor relevancia debido a que tienen una distribución mundial, que abarca desde regiones tropicales, hasta templadas.
Objetivo
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la dexametasona sobre la actividad de la proFO en la hemolinfa de mosquitos de la especie Aedes aegypti, con el propósito de, en un futuro, proponer estra- tegias en el control de estos vectores dentro de sus poblaciones naturales.
Metodología
Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compañías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems.
Para la realización de este proyecto, se obtuvieron mosquitos A. aegypti cultivados en el insectario del Centro de Investigación sobre Enfermedades Infec- ciosas (CISEI) de Cuernavaca, Morelos, bajo condi- ciones estándar (Chan et al., 1994) (Castex, Fachado y Fonte, 1997).
Obtención de la hemolinfa. Para la manipulación de A. aegypti, los ejemplares se sometieron a bajas temperaturas para inducir un estado de letargo. Se separaron en grupos experimentales de 15 hembras cada uno, la extracción de la hemolinfa se hizo me- diante una incisión en el abdomen y un centrifugado de 15 min, dejando caer la hemolinfa en 50 μl de NaCl (cloruro de sodio) al 0.8% para el grupo con- trol. Para los grupos experimentales, se agregaron concentraciones de 12.5, 25 y 50 μg/μl de dexame- tasona y se incubaron durante 30 min.
Electroforesis de proteínas. Para su análisis, se ex- trajeron proteínas, las cuales fueron obtenidas en pre- sencia de inhibidores de proteasas (minicomplete TM protease inhibitor Amersham Inc.), preparados en amortiguador PBS (19 mM NaH2 PO4, 8.1 mM Na2 HPO4, 154mM NaCl, pH 7.4). Esto se corrió en un gel de acrilamida (PAGE-SDS) al 10%, 100-110 Volts/2 h, colocando 17 μg de proteína. Se realizó la cuantifica- ción proteica por medio del método de Bradford.
La actividad enzimática se analizó mediante un método espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En los pozos de esta placa se agregó 30 μl de un sustrato, L-dopa (4 mg/ml) más el inhibidor, 12.5, 25 y 50 μl de hemolinfa y 30 μl del agente microbiano (LPS o Laminarina). Los cambios de tonalidad se analizaron
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004 19