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Facultad de Ciencia y Tecnología
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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004
El sistema inmune de la cucaracha de Madagascar (Gromphadorina portentosa) ha sido poco estudia- do. Esta cucaracha es un organismo endémico de la isla de Madagascar; en estado adulto mide entre 8 y 9 cm, y pesa alrededor de 15 g; su actividad es básica- mente nocturna y viven en grupos, sobre todo, en bosques. Actualmente, esta especie ha sido intro- ducida como mascota exótica en diversos países –en- tre los que se encuentra México– y en algunos lugares –como Madagascar– es considerada una potencial fuente alimenticia.
Conocer su sistema inmunológico resulta fundamen- tal para poder obtener cultivos libres de patógenos con fines comerciales. Así mismo, este estudio es importante porque en otros países –como Tailandia–, el crecimiento desmedido de su población represen- ta ya una amenaza; se ha convertido en una plaga contra la cual se han tomado medidas drásticas.
Objetivo
El objetivo de este trabajo es caracterizar y evaluar las moléculas del sistema de la proFO de la cucaracha de Madagascar (Gromphadorina portentosa). Para este fin, se evaluó la actividad de la profenoloxidasa de cucarachas tratadas con lipopolisacárido (LPS), medida por la respuesta humoral en la hemolinfa y los patrones de proteínas solas y en presencia de inhibidores de prostaglandinas.
Metodología
Hexápodos. Se utilizaron 27 blátidos de la especie Gromphadorina portentosa cultivadas en la Univer- sidad Simón Bolívar.
Obtención de hemolinfa. La hemolinfa se obtuvo de organismos juveniles por medio de perfusión y, en algunas ocasiones, mediante incisiones en el ab- domen, con la ayuda de tijeras.
Efecto de los inhibidores de prostaglandinas so- bre la actividad de profenoloxidasa. Para realizar este ensayo, se utilizaron 20 mg de proteína del sobrenadante de la hemolinfa (HSL) y se colocó en los pozos de una multiplaca de ELISA. Se le agregaron
20 μl de PBS 1X pH 7.4 y después se incubaron con 50 μl de zymosan o lipopolisacáridos de bacteria durante un periodo de 30 minutos. Después, se le agregaron 25 μl de L-dihidroxifenilalanina y se incubaron a tem- peratura ambiente por 20 minutos. Se observó el resultado y se midió la densidad óptica a 590 nm.
Análisis estadístico. Los diferentes tratamientos fueron sometidos a la prueba estadística de Kruskal- Wallis, con una p ≥0.25, con ayuda de SigmaStat 3.2.
Extracción de proteína. Se extrajeron 100 μl de hemolinfa de las cucarachas después de haber sido sometidas durante 30 minutos a 10 μl de naproxeno, y 10 μl de dexametasona en el caso de dos cucarachas experimentales (hubo una tercera cucaracha con- trol). La hemolinfa obtenida se repartió en tubos de microcentrífuga por separado. A cada muestra se le agregaron 10 μl de inhibidores de proteasas y 60 μl de PBS. Las tres muestras se hirvieron durante 10 minutos y después se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante se colocó en tubos nuevos, a los cuales se les agregaron 2 μl de ß-mercapto-etanol. Una vez obtenidas las muestras, se corrieron en un gel de proliacrilamida (PAGE-SDS) al 10%, el cual, posteriormente, fue teñido con azul coomassie.
Observación microscópica de hemocitos. Para realizar la observación de hemocitos se extrajo hemolinfa de un organismo adulto y se colocó en un tubo de microcentrífuga (con una solución salina al 0.9%, con el objetivo de evitar la muerte celular). Se tomaron tres gotas de la suspensión y se colo- caron en portaobjetos distintos; a dos de éstos se les agregó una gota de naproxeno y dexametasona, respectivamente. Se dejaron reposar durante 10 minutos y después se observaron las tres muestras al microscopio óptico (Zeiss mod. Junior, serie 1210J18658 MB1).