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Facultad de Ciencia y Tecnología
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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004
Metodología
Material biológico. Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron larvas, pupas y adultos hembras y machos de una colonia de mosquitos An. albimanus cepa franja blanca (Chan et al., 1994), establecida en el Centro de Investigación de Paludismo en Tapa- chula, Chiapas, México. También se utilizó una ge- noteca construida a partir de cDNA de glándulas salivales del vector An. albimanus hembra (Montero et al., 2004).
Identificación del RNAm que codifica para D7r de An. albimanus (AnaD7r). A partir de la genoteca de cDNA de glándulas salivales de An. albimanus, se aislaron clonas al azar y cada una de estas clonas de cDNA se secuenciaron parcialmente con el sistema Big Dye (Perkin Elemer) y se analizaron los productos en el secuenciador automático ABI-PRISMTM (Perkin Elmer). La secuencia del inserto de una de las clonas se identificó como una molécula relacionada con D7, la cual se le denominó AnaD7r y se eligió para conti- nuar con este trabajo.
Digestión enzimática del plásmido que con- tiene el cDNA que codifica para AnaD7r. El plás- mido que contiene el cDNA de AnaD7r se digirió con 1U de cada una de las endonucleasas Eco RΙ y Xho Ι (Gibco-BRL, N.Y. USA) a 37 oC durante 4 horas y los productos se analizaron en un gel de agarosa (Invitrogen, Nueva Zelanda, USA) al 1.5% adicio- nado de 0.2 μg/ml de bromuro de etidio (Sigma, St. Louis MO, USA).
Análisis de secuencia. Para el análisis y compara- ción de secuencias, se utilizó el programa BLASTP v.2.2.6 (Altschul et al., 1997), disponible en la página Web del Centro Nacional para Información Biotecno- lógica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El análisis del probable producto de traducción, alineamientos y posibles modificaciones postraduccionales de ese producto, se obtuvo a través de los programas SIX- FRAME, CLUSTALW (V.3.2) y PROSEARCH, respectiva- mente, disponibles en la página Web del Centro de Cómputo de San Diego (http://www.sdsc.edu). La predicción del péptido señal se realizó mediante el programa SPORT, disponible en su servidor Web (http://psort.nibb.ac.jp/).
Extracción de RNA de diferentes órganos y estadios de desarrollo de An. albimanus. Para aislar RNA, los diferentes órganos del mosquito se disectaron y se colocaron en TrizolTM (Gibco-BRL), así como la cabeza y tórax de diferentes estadios de
desarrollo del mosquito. La extracción de RNA con TrizolTM se hizo de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El RNA aislado de cada muestra se cuan- tificó en un espectrofotómetro BECKMAN (modelo DUR 640), a una longitud de onda de 260 nm.
Transcripción en reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La expresión del gen AnaD7r se estudió por medio de RT-PCR. Para cada reacción de RT-PCR, se utilizó 1 μg de RNA de los diferentes órganos y estadios de desarrollo de An. albimanus. La primera cadena de cDNA se sintetizó con el iniciador AP (5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3') y la retrotranscriptasa recombinante SuperScript II (Gibco-BRL). Después de la transcripción en reversa (42 oC durante 50 min) y de la inactivación de la enzima (70 oC durante 15 min), se hizo una reacción de amplificación de 35 ciclos con los parámetros siguientes:95oC,20s;50oC,20sy72oC,1mincon los iniciadores D7-N (5'-TGTGAACTGCGCCAGTACAC-3') y D7-C (5'-GATCTGCCCGGCGTTGAATG-3').
Resultados
Identificación del cDNA de AnaD7r. Las clonas aisladas al azar de la genoteca de cDNA de glándulas salivales se secuenciaron en sentido y contrasentido. Se analizaron las secuencias obtenidas, y una de ellas tuvo alta homología con moléculas D7r de diferentes especies de Anopheles existentes en la base de datos. Para conocer el tamaño aproximado del cDNA que traduce para AnaD7r, el plásmido que lo contiene se digirió con las endonucleasas Eco RΙ y Xho Ι. Esta digestión produjo un inserto con un tamaño de ~700 pb (Figura 2).
Figura 2. Digestión enzimática del plásmido pBluescript SK(+/-) conteniendo el cDNA que codifica para AnaD7r
pb
carril 1
— 2,900
— 700
carril 2
El plásmido pBluescript se digirió con la enzima Eco RΙ y Xho Ι, liberando un producto de ~700 pb. En el carril 1 se muestra el marcador de número de pares de bases (100 bp DNA Ladder, Gibco- BRL) y en el carril 2, el plásmido con el producto liberado.