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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 10, No10, DICIEMBRE 2011
Facultad deCiencia y Tecnología
tivo debido a altas concentraciones de hierro en el tracto respiratorio bajo, se ha relacionado con muchas enfermedades como neumonías bacte- rianas, fibrosis quística, sarcoidosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enferme- dades intersticiales, sepsis, carcinoma bronquial, silicosis, asbestosis, mesotelioma, neumoconiosis, enfermedades inflamatorias de pulmón, sidero- elastosis, asma, tuberculosis y hemorragia alveolar (Zelikoff et.al., 2002).
En este estudio se evaluaron los niveles de expre- sión de los genes de ferritina (Fer) y del recpetor a la transferrina (TfR), como los únicos genes expre- sados en pulmones de niños. El objetivo fue evaluar si las variaciones en estos marcadores se asocian al tipo de aire y lugar de residencia de los niños.
Método
Tejido pulmonar humano
Como es un estudio exploratorio, primeramente se dio énfasis a las diferencias en el lugar de residen- cia; así se analizaron 19 casos de niños residentes del Distrito Federal (DF) y 15 casos de resientes de provincia. Si se encontraran diferencias, pos- teriormente se realizará un análisis detallado de los sitios donde residieron los niños, así como las costumbres tanto de ellos como de los padres, como la actividad laboral, así como rumbos de la ciudad. El tejido pulmonar incluido en parafina, se seleccionó del banco de autopsias realizadas en el Departamento de Patología del Hospital Infantil de México Federico Gómez, de la Secretaría de Sa- lud. Estos casos fueron de niños mayores de 3 años de edad que fallecieron por algún padecimiento no respiratorio. Los casos fueron de ambos sexos. De los protocolos de autopsia se obtuvieron los datos de edad, sexo, lugar de residencia; así como el diagnóstico de muerte. Los tejidos fueron con- firmados como parénquima pulmonar por análisis de los cortes histológicos teñidos con H&E.
Diseño de los iniciadores de los genes de estudio
Las secuencias de los iniciadores para cada uno de los genes se obtuvieron del trabajo previo hecho por Fernandez-Castillo y cols. (2008). Las secuencias fueron las siguientes:
Fer-F: 5´-TCGCAGGTGCGCCAGAACT-3´, Fer-R: 5´-GCAAAGTTCTTCAAAGCCACAT-3´; TfR-F: 5´-CTGCCAGCTTTACTGGAGAA-3´, TfR-R: 5´-CATTGTCAATGTCCCAAACGT-3´; b-actina-F: 5´-CAAGAGAGGCATCCTCAC-3´, b-actina-R: 5´-CAGCTAATTGTAGAAGGTG-3´,
Los iniciadores se diseñaron con el objeto de generar productos amplificados, de preferencia menores de 200 pb, porque el RNAm fue aislado de tejido incluido en parafina. Los tamaños de los amplifica- dos fueron los siguientes: Fer, 140 pb; TfR, 151 pb; y b-actina, 103 pb.
Aislamiento del RNAm de los cortes histoló- gicos incluidos en parafina
Tres cortes de 8 mm de tejido pulmonar, fueron desparafinados con xileno a 50° C y posterior- mente con 2 cambios de alcohol absoluto, hasta secarlos durante 15 min. Posteriormente se realizó la extracción del RNAm de acuerdo a la descripción técnica contenida en el “RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation” (AMBION). Posteriormente se elu- yó el RNA limpio de la resina con 60 ml de agua libre de RNasas, y finalmente el RNA purificado del tejido se almacenó a -20° C con 1 ml de inhibidor de RNasas.
Síntesis de cDNA y amplificación de los frag- mentos de los genes de Fer, TfR, y b-actina
Tres ml de cada RNA se sometieron a síntesis de cDNA de acuerdo a la condiciones descritas en el “First Strand cDNA Síntesis Kit” (Fermentas). Las reacciones de amplificación de los fragmentos de los genes de estudio se realizaron en un ter- mociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf), en un volumen final de 50 ml. Las condiciones de la amplificación fueron: desnaturalización inicial, 95°C/5 min; ciclo de amplificación: desna- turalización 95°C/30 s, alineamiento Tm-2°C/30 s, elongación 72°C/30 s; elongación final 72°C/5 min y salida 20°C. Se utilizó el sistema de P1 Taq DNA polimerasa (Fermentas). El análisis final se realizó a 30 ciclos de amplificación, en las cuáles no existió saturación en la reacción (resultados no mostrados).