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Previamente, se evaluaron los iniciadores sintetiza- dos, realizando amplificaciones sobre cDNA de la línea celular A549 de adenocarcinoma pulmonar, la cual expresa los genes de la vía del metabolismo del hierro. Los resultados de la figura 3 confirmaron el diseño correcto de los iniciadores utilizados, y la especificidad de las condiciones de la reacción.
Figura 3.
Fragmentos amplificados de los genes de ferritina (Fer), receptor a transferrina (TfR) y b-actina (b-ac), sobre el cDNA de la línea celular A549. Fer, 140 pb; TfR, 151 pb; b-ac, 110 pb. PM, marcador de 100 pares de bases. Productos separados en gel de poliacrilamida y teñidos con plata.
Análisis de las bandas de amplificación, den- sitometría de los productos y obtención de la relación de expresión
Las bandas de amplificación de cada gen se reve- laron en geles de poliacrilamida al 12% mediante la tinción de plata. Previamente los geles se fijaron en etanol 10%-ácido acético 0.5% durante 10 min con agitación. A continuación se expusieron en la solución de tinción de nitrato de plata al 0.2% preparada en la misma solución fijadora durante 5 min con agitación. Finalmente, las bandas se re- velaron en hidróxido de sodio al 3%-formaldehído 0.15% hasta su aparición. De cada gel se obtuvieron imágenes digitales y en estas se cuantificó por den- sitometría la intensidad de cada banda, utilizando el programa ImageJ. Por último, se obtuvo la relación de expresión dividiendo la densidad integrada de cada gen problema entre la obtenida del gen cons- titutivo, b-actina.
Análisis estadístico
Se obtuvo la media de expresión de cada gen y se evaluaron las diferencias de expresión de cada grupo: CM y Provincia mediante la prueba “t” de student. Se consideraron significativas cuando el valor de p fue menor a 0.05.
Resultados
Los 32 de 34 casos estudiados expresaron el gen constitutivo b-actina, y fueron considerados para el estudio y análisis de expresión de los genes Fer y TfR. Este resultado corroboró que el RNAm extraído de estos casos se encuentra en condiciones óptimas para su estudio ( ver figura 4):
Figura 4.
RT-PCR de los genes de Fer, TfR y b-ac sobre el cDNA obtenido de algunos casos, en tejido pulmonar de niños residentes de la CM (2A) y de Provincia (2B). Cada carril es un caso diferente. A549, línea celular; PM, marcador de 100 pares de bases. Productos separados en gel de poliacrilamida y teñidos con plata.
Posteriormente se procedió a cuantificar por den- sitometría los fragmentos amplificados de cada uno de los genes por caso, y obtener la relación de expresión con respecto al obtenido de b-actina. De esa manera se obtuvo el promedio de expresión y su desviación estándar por gen y por grupo: re- sientes de Prov y de la CM (Tabla 1). Los resultados mostraron una elevación en la expresión de ambos genes en los niños residentes de la CM. De hecho, los genes de Fer y del TfR se expresaron 1.8 y 1.5 veces más, respectivamente, que el observado en niños residentes de Prov. Las diferencias fueron significativas sólo para la expresión del gen del TfR entre los niños de la CM y de Prov (p < 0.05). Previamente (Fernández-Castillo et. al, 2009) se demostró por nuestro grupo de trabajo, que son un número menor de genes que se expresan en el pulmón, de los reportados por Ghio y cols. (2006). También se investigó la expresión de los genes de la hemo-oxigenasa 1 y de ferroquelatasa pero no se documentó su expresión en tejido pulmonar de niños. Por eso sólo se presentan los resultados ob- tenidos del análisis de 2 genes: la Fer y el TfR.
Facultad de Ciencia y Tecnología
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 10, No 10, DICIEMBRE 2011
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