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Tratamiento de los estómagos. Los estómagos disectados se colocaron en una caja multicámara de 24 pozos, 50 estómagos por pozo con 500 μl de medio Schneider´s únicamente como control o añadiendo PGE2 (Sigma-Aldrich St. Louis Mo, cat P5640, presentación soluble en agua) a 35 mg/ml (añadidos al medio a partir de una solución stock 35mg/ml en agua). Los estómagos se incubaron a temperatura ambiente (Ta) durante 2 horas (García- Gil et. al., 2008). Posteriormente, los estómagos tratados se colectaron y centrifugaron a 2000 rpm durante 1 minuto, se eliminó el sobrenadante, se lavaron con PBS (140 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 20mM Na2HPO4, pH 7.2) y se centrifugaron a 2000 rpm durante 2 minutos. Los estómagos se resuspendieron en el amortiguador de lisis (vide infra), adicionado de inhibidores de proteasas (IP) [5 mM de tosil-lisil-clorometilcetona (TLCK), 5 mM de fenil-alanilclorometil cetona (TPCK), 10 μM de Leupeptina, 50 mM de fenil-metilsulfonil fluoruro (PMSF) y la mezcla comercial CompleteTM (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)]. Las muestras se almacenaron a -70o C hasta su uso.
Preparación de las muestras para electrofo- resis bidimensional. Las muestras de estómagos se homogeneizaron en Amortiguador de Lisis (AL) para isoelectroenfoque (IEF) (AL: urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4%, amortiguador de anfolinas (IPG, General Electric Healthcare) pH 4-7 al 2%, DTT 40 mM) en presencia de inhibidores de proteasas, con 5 ciclos de congelación/descongelación en nitró- geno líquido/temperatura ambiente, y dando 50 golpes cada vez con homogenizadores de plástico para tubo de microfuga de 1.5 ml (Tissue grin- ders PES-15-B-SI, Axygen/Corning). Para eliminar contaminantes, las muestras se precipitaron con acetona (1:5) y resolubilizaron en AL adicionado de IP. Para eliminar lípidos y algunos carbohidratos, las muestras se trataron con metanol y clorofor- mo y la pastilla se solubilizó en amortiguador de hidratación (AH, urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 2%, amortiguador IPG 0.5%, DTT 40 mM, azul de bromofenol 0.002%) suplementado con IP. La concentración de proteínas se cuantificó con el kit 2-D Quant (Amersham Biosciences, GE Healthcare).
Análisis proteómico. El análisis de las proteínas se realizó mediante electroforesis bidimensional (E2D), la primera dimensión se realizó por isoelec- troenfoque (IEF) utilizando tiras prefabricadas de 7 cm con gradiente de pH 4-7 (Inmobiline Drystrip, GE Healthcare) hidratadas durante 16 h en presencia de
la muestra (150 mg de proteína en 125 ml de AL), en el sistema Ettan IPGPhor 3 (GE Healthcare) con ~7000 Vh acumulados durante 3.5 h (Görg et. al., 2000). Antes de correr la segunda dimensión, las proteínas enfocadas en las tiras se redujeron y oxidaron en amortiguador de equilibrio (AE: urea 6 M, glicerol 30%, SDS 2%, Tris 50 mM, pH 8.8) en presencia de DTT 1% y iodoacetamida 4%, repectivamente, durante 15 min. Posteriormente las proteínas se separaron en la segunda dimensión mediante elec- troforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS) en geles al 12% (Laemmli, 1970). Al término de las corridas los geles se tiñeron con azul de Coomassie Coloidal G250 (BioSafe, BioRad). Las imágenes de los geles se obtuvieron en un fotodo- cumentador ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare). La intensidad de las manchas de c/u de las proteínas en los geles teñidos, la cual es proporcional a la concentración de la molécula, se cuantificó anali- zando las imágenes con el software Image Master 2D Platinum v7.0 (GE Healthcare) y se expresó como volumen relativo expresado en unidades arbitrarias definidas por el software. Los experimentos se realizaron por duplicado y los valores de densidad óptica se promediaron y la comparación estadística entre condiciones se hizo mediante prueba de t para dos muestras.
Análisis de las proteínas por espectrometría de masas (ESI-LC-MS/MS). Las manchas teñidas en los geles E2D correspondientes a proteínas diferenciales se escindieron del gel y se procedió a la digestión directa de la proteína contenida en el fragmento de gel (in-gel digestion) usando trip- sina y los péptidos se recuperaron. Para eliminar contaminantes, la muestra se hizo fluir a través de una columna C18 (Millipore) y se analizó mediante ESI-LC-MS/MS (ElectroSpray Ionization-Liquid Chro- matography-Mass Spectromic/Mass Spectromic), en un espectrómetro de masas Micromass QTofI-LC (Waters, USA). Debido a que el genoma de An. albimanus no está secuenciado, para identificar a las proteínas seleccionadas se utilizó el método de ESI-LC-MS/MS el cual utiliza MS en tándem para fragmentar un péptido específico en péptidos más pequeños en los que se puede deducir la secuencia de aminoácidos, considerada como una etiqueta (peptide sequence tag, PST) que da información estructural irrefutable. Para identificar las proteí- nas, los fragmentos se analizaron con el programa MASCOT usando las bases de datos accesibles en línea incluyendo SwissProt, NCBInr y las divisiones de ESTs de EMBL, en http://www.matrixscience.com/.
Facultad de Ciencia y Tecnología
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No 12, ENERO - DICIEMBRE 2013
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