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Discusión
Se sinterizaron dos conjugados hapteno-acarreador para dos reguladores de crecimiento vegetal de- terminantes para desencadenar respuestas mor- fogénicas in vitro en vegetales (Cooke, Racusen y Cohen, 1993; Yasuda, Fujii y Yamaguchi, 1985), con el objetivo de producir anticuerpos policlonales, para usarlos como reactivos de diagnóstico en inmu- noensayos. Para el compuesto 2,4-D se han diseñado y desarrollado procedimientos por inmuoensayos acoplados a radioisótopos (Knoop, 2005), pues es un contaminante químico muy tóxico (World Health Organization, 1984) y gracias a ellos es posible detectar sus niveles en individuos expuestos. Sin embargo, su aplicación para investigación en el área de fisiología vegetal, como se pretende hacerlo en el presente trabajo, no se ha contemplado. El 2,4-D es el regulador de crecimiento vegetal para inducir el proceso de embriogénesis somática. Establecer los mecanismos de acción de éste en especies vege- tales recalcitrantes (Quiroz-Figueroa, Méndez-Zeel, Larqué-Saavedra y Loyola-Vargas, 2001), abriría el camino para la manipulación acertada del proceso, lo que implicaría alcanzar productividades elevadas (Payne, Bringi, Price y Shuler, 1992).
El diseño de los llamados inmunoconjugados para componentes cíclicos y con el grupo benceno, de igual forma, se elaboran (Yacovleva et. al., 2003), pero no se tiene informes que se hayan hecho para la molécula de Kinetina, en particular. Existen re- ferencias en donde se han generado anticuerpos contra zeatina, isopentil adenina y para estas mo- léculas unidas a ribonucleosidos (Nicander, Stálh, Björkman y Tillber, 1993; Morris, Jameson, Laloue y Morris, 1991), todas ellas análogos de Kin. En este sentido, los antisueros obtenidos en el presente trabajo para el conjugado Kin-proteína resultan ser reactivos muy valiosos.
Los conjugados inmunogénicos reguladores de crecimiento vegetal-proteína, se sintetizaron por medio de los grupo amino libres expuestos en la proteína acarredora, y uniéndolos por el uso de glutaraldehído, como reactivo de acoplamiento (Erlanger, 1973). Este método ha mostrado ventajas debido a que permite a la mayoría de las partes características del hapteno no cambiar, es decir, per- manecer inalteradas (Aehringhaus, Wölbing, König, Patrono, Peskar y Peskar, 1982), lo que favorece la generación de antígenos muy parecidos al hapteno original, lo que redundaría en producir antisuero
con anticuerpos específicos. Los resultados de la prueba de doble difusión de Oüchterlony hecha con el conjugado Kin-proteína y con el suero anti-Kin- proteína confirman lo anteriormente expuesto. Pues los anticuerpos obtenidos reaccionaron únicamente con el conjugado que les dio origen, haciéndolos característicos y distintivos para el inmunoconju- gado en cuestión. La excepción a tal correlación fue el conjugado 2,4-D-proteína, que en la misma prueba, resultó negativo a la formación de bandas de precipitación de identidad.
Asimismo, el cálculo de la titulación de los grupos amino libres confirma los resultados obtenidos en la prueba de Oüchterlony, pues se obtuvieron 81.23 unidades de lisina usada por la incorporación del regulador de crecimiento vegetal Kin. Lo cual correspondió a 82.13% de BSA ocupada y 17.87% de BSA libre. En cambio, para el 2,4-D la diferencia de extinción entre su conjugado (2,4-D-proteína) y la muestra de referencia (BSA, es decir, βE) fue un valor negativo, lo que implica que no hubo incorporación del 2,4-D a la BSA o fue escasa para estimular la formación de anticuerpos en los conejos y ser detectada por el método espectrofotométrico usado. Por lo que las bandas de precipitación obser- vadas en la prueba de doble difusión corresponden únicamente a la reacción cruzada con anticuerpos obtenidos contra BSA, la proteína acarreadora, y no contra el 2,4-D.
De acuerdo con los resultados y tomando en cuenta las referencias bibliográficas con relación a la efec- tividad del método de síntesis de conjugados usado en el presente trabajo, es menester replantear las pruebas para caracterizar al suero anti-2,4-D-pro- teína. El empleo de varios isómeros de la molécula 2,4-D (Yacovleva et al., 2003; Aehringhaus et. al., 1982) en ensayos tales como ELISA, posiblemente se identificaría a el (o los) determinante(s) antigénico(s) inmunodominante(s) que motivó(aron) los anticuer- pos observados y probablemente, identificar si se produjeron algunos contra 2,4-D.
Conclusión
Fue posible obtener conjugados hapteno-acarrea- dor con el regulador de crecimiento vegetal Kine- tina, con capacidad para generar la producción de anticuerpos policlonales.
Facultad de Ciencia y Tecnología
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No 12, ENERO - DICIEMBRE 2013
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