Page 167 - InvUnivMult2013

Facultad de Ciencia y Tecnología
Para la doble difusión de Oüchterlony, a portaobjetos limpios y desgrasados con etanol, se les colocó 1 ml de agarosa al 0.3% disuelta en solución salina fisiológica y, después de polimerizar, 2 ml de agarosa al 0.9% en solución salina fisiológica. Se hicieron perforaciones equidistantes de aproximadamente 0.5 cm de diámetro, una central, en donde se colocaron los antisueros, y periféricas a la primera, en las que se agregaron los conju- gados en solución (0.05 mg/ml). Se incubaron por 24 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda hecha con cajas de Petri con papel filtro húmedo con agua destilada. Se fotografiaron las bandas de precipitación.
Resultados
Algunas de las fases para la síntesis de los dos conjugados hapteno-acarreador con los reguladores de cre- cimiento vegetal 2,4-D y Kinetina (haptenos), cada uno con la proteína BSA, como molécula acarreadora, se muestran en la figura 1. Es posible apreciar la consistencia grumosa o viscosa, no líquida, que se produce durante la incubación de la mezcla de reacción, que se hace aún más evidente conforme se termina este pe- riodo (figura 1a y 1c). Con el conjugado Kin-proteína el cambio de consistencia fue menos evidente (figura 1d) que con 2,4-D-proteína (figura 1a). Este estado de agregación perduró después de la diálisis (figura 1b) e hizo difícil disolver el conjugado 2,4-D-proteína en PBS durante su preparación para los posteriores ensayos. No fue el caso para el conjugado Kin-proteína (figura 1c y 1d). Se cambió el procedimiento para producir el conjugado con 2,4-D por los resultados obtenidos con el protocolo propuesto por Knopp (2004). Con este, el producto de la reacción nunca dejó de ser líquido hialino (resultados no mostrados). El procedimiento modificado que se siguió fue el que se expone en método.
Figura 1. Síntesis de conjugados hapteno-acarreador de los reguladores de crecimiento vegetal ácido 2,4-diclorofenoxiacético (a y b) y Kinetina (c y d). Fin de la reacción de síntesis del conjugado 2,4-D-proteína (a), inicio de diálisis del conjugado 2,4-D-proteína (b) y Kin- proteína (c), recuperación del conjugado Kin-proteína de la bolsa de diálisis (d)
La incorporación de los haptenos a la proteína BSA fueron en proporción de 82.1% para el conjugado Kin- proteína y para el 2,4-D-proteína no se pudo calcular debido a que la βE fue negativa y los resultados sobre- pasaron el 100% de incorporación.
Después de 8 semanas de estimulación con el conjugado 2,4-D-proteína se obtuvo el suero de los conejos inmunizados y se analizaron con la prueba de precipitación en capilar (figura 2a). El título que se obtuvo fue 1:128. Por otro lado, al término del protocolo de inmunización para el conjugado Kin-proteína, la prueba de precipitación en capilar arrojó un título de 1:512 (figura 2b).
Se hizo la prueba de Oüchterlony, en la cual no se obtuvieron bandas de precipitación usando el hapteno como antígeno (datos no mostrados). Al hacerla con los conjugados, se obtuvieron bandas de identidad con los sueros anti-2,4-D-BSA (figura 3a) y anti-Kin-BSA (figura 3b). Estas bandas se aprecian como una continua entre los pozos 2 y 4 de las figuras 3a y 3b. Además, esta técnica permitió identificar los sistemas antígeno- anticuerpo presentes en los antisueros elaborados. En la figura 3, se muestra la existencia de bandas de precipitación adicionales a la de identidad, anteriormente mencionada, evidenciadas por las cabezas de
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No 12, ENERO - DICIEMBRE 2013
167