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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 8, No8, DICIEMBRE 2009
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Ciencia y Tecnología
tión, las cuales son importantes para el desarrollo y transmisión de agentes patógenos. En este trabajo se analizaron las proteínas del estómago del mos- quito Ae. aegypti que se modifican después de la alimentación con sangre, observándose variaciones notorias en la concentración de algunas de ellas, incluyendo al homólogo de la serpina 4A, la cual se identificó mediante MALDI-TOF/MS.
Método
Reactivos. Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la mayor calidad posible de las marcas Sigma Chem Co. (St. Louis MO); BioRad (Hercules CA) e Invitrogen (Bethesda MA).
Mosquitos. Los mosquitos Ae. aegypti de la cepa Cuernavaca, la cual fue establecida a partir de mosquitos silvestres de la ciudad de Cuernavaca, Morelos, fueron proporcionados por el Insectario del Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas del Instituto Nacional de Salud Pública (CISEI-INSP). Los mosquitos fueron alimentados durante su vida adulta con solución azucarada al 10% administrada ad libitum. Para los experimen- tos se usaron hembras adultas de 4 a 5 días post- emergencia. Previo a la alimentación con sangre, los mosquitos se dejaron en ayuno de azúcar por 12 h, para inducir el comportamiento de búsqueda de alimento. Posteriormente se alimentaron con sangre de ratón (Balb/c, cepa de laboratorio mantenida según la reglamentación de la NOM-062-ZOO-1999), fijando las jaulas de mosquito a la superficie de los animales hasta que se observó que la mayor parte de los insectos presentaba coloración roja en el abdomen. Los estómagos se disectaron a diferentes tiempos (3, 6, 9 h) post-alimentación, descartando a los que no se alimentaron (Chan et al., 1994).
Disección de estómagos de mosquitos Ae. aegypti alimentados con azúcar y con sangre. Para disectar los estómagos, los mosquitos se in- movilizaron a 4°C y se mantuvieron en una caja de Petri sobre hielo. En un portaobjetos se colocó una gota de solución amortiguadora de fosfatos (PBS 1X: KH2PO4, 0.2g, NaCl 8.0, Na2PO4 2.2g, KCl 0.2g en 1000 ml, pH 7.4) y en ella un mosquito. Mediante el uso de agujas de disección y bajo el microscopio estereoscópico, se sujetó al mosquito del tórax y se jaló suavemente desde el 4o segmento abdominal descubriendo el aparato digestivo al cual se le
realizaron cortes para separar el intestino medio del anterior y posterior y se eliminaron los túbulos de Malpighi. Una vez obtenidos los estómagos, éstos fueron colocados en 30 μl de PBS a pH 7.4 y adicionados con 20 μl de una solución concentrada de inhibidores de proteasas (PMSF 100 mM, TPCK 10 mM, TLCK 10 mM, Leupeptina 10 mM, NaVO4 100 mM, NaF 100 mM). Por último, se almacenaron a -70°C hasta su uso. La disección de los estómagos de mosquitos alimentados con sangre se realizó de manera similar, con la variación de que al obtener el órgano con sangre, se le realizó un corte en los extremos para extraerle la sangre y se lavó con PBS pH 7.4 para eliminar los restos de sangre.
Grupos de 200 estómagos se pusieron en 50 μl de PBS pH 7.4 e inhibidores de proteasas y se almace- naron a -70°C hasta su uso. Por otra parte, la sangre que se extrajo del estómago (contenido estomacal, CE) se guardó, en el mismo volumen de PBS 1X pH 7.4 e inhibidores de proteasas, a -70°C (Cázares-Raga et al., 1998).
Extracción de proteínas totales de estómagos de Ae. aegypti alimentados con sangre. Para extraer las proteínas totales de los estómagos de tanto los alimentados con azúcar como con sangre, los órganos se homogenizaron por 5 min en un tubo Eppendorf con su pistilo de plástico. El extracto se centrifugó a 14,000 x g por 15 min. a 4° C y se separó el sobrenadante (SND) para posteriormente analizarlo mediante PAGE-SDS al 12%.
Cuantificación de proteínas. Las proteínas se cuantificaron utilizando el kit DC Protein Assay (Bio-Rad, California, USA) y utilizando un espectro- fotómetro a 750 nm.
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS). El análisis de las proteínas se realizó mediante geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) al 12% (Lae- mmli, 1970). Se analizaron 150 estómagos de mos- quitos equivalentes a aproximadamente 100 μg de proteína. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie o con nitrato de plata (Wray et al., 1969). Para calcu- lar el peso molecular de las proteínas, se utilizaron los marcadores preteñidos de Bio-Rad (Precision Plus Protein Dual Color Standards, Bio-Rad).
Identificación de las proteínas mediante espec- trometría de masas (MS). Para la identificación de proteínas de interés resueltas por PAGE-SDS, se