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Facultad de Ciencia y Tecnología
Método
Características de los casos y las muestras de estudio
Las muestras tumorales se obtuvieron por resección quirúrgica de un grupo de pacientes que fueron atendidos en el Hospital Infantil de México “Federico Gómez” entre 1999 al 2009. Las biopsias se fijaron en formalina al 10% para incluirse en parafina y llevar a cabo el diagnóstico histopatológico y confirmado por 2 evaluadores, para clasificarse de acuerdo a las organización mundial de la salud en grado I, II, III y IV. Sólo se incluyeron aquellas muestras que contenían al menos 70% de la lesión tumoral en el corte. De esta manera quedaron repartidos los casos en:
• 15 de grado I
• 12 de grado II
• 12 de grado III y • 15 de grado IV.
Los datos clínicos tales como grado tumoral, recurrencia y supervivencia se correlacionaron con la expresión del gen Bax.
Extracción de RNA y reacción de RT-PCR del gen Bax
EL RNAm de cada tumor fue extraído de acuerdo con las instrucciones contenidas en el kit “Recover All Total Nucelic Acid Isolation” (AMBION), optimizado para tejidos incluidos en parafina. El cDNA se sintetizó a partir de 0.5 mg del RNA total utilizando un oligo (dT) de 15 politiminas, en un volumen final de 50 ml, de acuerdo con las instrucciones del kit TITAN (Roche). Las secuencias de los iniciadores para amplificar los fragmentos de los genes Bax y b-tubulina fueron: Bax-F: 5’-AAGCTGAGCGAGTGTCTCA-3’; Bax-R: 5’- TCATCTGGTAAGTCGTGCT-3’; b-TUB-F: 5’-ATCGCCGCGCTCGTCGT-3’; and b-TUB-R: 5’-GGCATCGTCGCCCGCG-3’. Las condiciones de la amplificación fueron desnaturalización inicial, 94°C/30s; 56°C/30s y 72°C/30s, a repetir por 30 ciclos; finalmente un ciclo de elongación a 72°C por 5 min y de salida a 20°C/5min.
Las bandas amplificadas se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y tinción con bro- muro de etidio y luz ultravioleta. La imagen se grabó utilizando un analizador de imágenes para obtener el archivo digital.
Análisis densitométrico
La intensidad de cada banda de los fragmentos de los genes de Bax y de b-tubulina fue cuantificada utilizando el programa Image J. De esta manera, se obtuvo la densitometría de cada una para calcular la relación de ex- presión dividiendo la densidad del gen Bax de cada caso, entre la obtenida del gen b-tubulina correspondiente.
Análisis estadístico
El tiempo de supervivencia (meses) de los pacientes se expresó utilizando la mediana como medida de tenden- cia central. Las diferencias en los meses de supervivencia entre pacientes positivos o negativos a la expresión de Bax, se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. Para evaluar las diferencias en los casos positivos y negativos a la expresión de Bax en cada uno de los grupos, se utilizó la prueba de ji cuadrada. En ambos casos se consideraron significativas las diferencias cuando el valor de p fue menor a 0.05. También se realizaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (regresión logística); así como un análisis multivariado de variables de supervivencia clásicas como grado y localización con la presencia de Bax.
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 10, No 10, DICIEMBRE 2011
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