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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No12, ENERO - DICIEMBRE 2013
Facultad de Ciencia y Tecnología
Adicionalmente, se identificaron a los hongos potencialmente comestibles mediante una revisión y comparación
bibliográfica.
Métodos moleculares. La extracción de DNA de las muestras de tejido consistió en macerar 0.1 g de muestra en 750 μl de buffer de extracción (Urea 7M, NaCl 0.35M, Tris base 0.05M, EDTA 0.02M, Sarcosina 1%), centrifugar a 12000 RPM por 1’ y tomar el sobrenadante, limpiar con 500 μl de fenol-cloroformo (1:1), centrifugar a 12000 RPM por 3’ y tomar la fase acuosa, precipitar con 500 μl de isopropanol y 50 μl de acetato de amonio 10M, centrifugar a 12000 RPM por 10’ y tirar el sobrenadante, lavar con etanol 70%, centrifugar a 12000 RPM por 3’ y tirar el sobre- nadante, finalmente resuspender en 50 μl de H2O.
A partir del DNA genómico extraído, la región D1/D2 del gen nuclear LSU rDNA fue amplificado por PCR con el par de iniciadores específicos LR0R (ACCCGCTGAACTTAAGC) y LR3 (CCGTGTTTCAAGACGGG) (White, Bruns, Lee y Taylor, 1990).
La PCR se efectuó con las siguientes concentraciones: 2.5 mM MgCl2, 2.5 μM de cada dNTP (Sigma-Aldrich Quimica), 10 μM de cada primer (Sigma-Aldrich Quimica), 2 U Taq polimerasa (Invitrogen, Life Technologies), 1X de Buffer de amplificación (Invitrogen, Life Technologies); y se llevó a cabo en un termociclador (Aplied Biosistems) procediendo con el siguiente programa: (1) 94°, 3 min; (2) 5 ciclos de: (I) 94°, 1 min; (II) 45°, 1 min; (III) 72°, 1 min; (3) 30 ciclos de: (I) 94°, 1 min; (II) 50°, 1 min; (III) 72°, 1 min; (4) 72°, 5 min; (5) 4° continuo (Dahlman et. al., 2000). Se comprobó la am- plificación de los fragmentos mediante una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1%; los fragmentos de aproximadamente 450 pb fueron secuenciados utilizando un secuenciador Applied Biosystems 3130 de 16 capilares.
Las secuencias resultantes se compararon en el GenBank, mediante una búsqueda BLAST. Las muestras se caracte- rizaron de acuerdo con la máxima identidad presentada por los registros del GenBank. Además cada secuencia se comparó con las tres secuencias más afines para reconstruir, mediante métodos bayesianos, el árbol filogenético de los hongos del género Amanita utilizando el software MrBAYES (Huelsenbeck et. al., 2012); Se utilizó el modelo evolutivo HKY85 + G determinado por el software JModelTest (Darriba, Taboada, Doballo y Posada, 2012).
Resultados
Se colectaron 27 cuerpos fructíferos de hongos pertenecientes al género Amanita en los alrededores de Villa del Carbón (cuadro 1).
Cuadro 1. Hongos colectados pertenecientes al género Amanita, números de colecta y nombres vernáculos mencionados por la población encuestada
Especímenes
Género y especie
Nombres vernáculos
VC078
Amanita annulatovaginata
N. I.
VC118
Amanita caesarea
Huevo, Kechimón
VC116, 144
Amanita flavoconia
Kechimoncillo, Kechimón corriente
VC104
Amanita sp.
N. I.
VC134
Amanita sp. 2
Mantequero blanco
VC076, 079, 081 084, 085, 086, 088, 092, 093, 102, 103, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 128, 136, 137
Amanita rubescens
Mantequero, manteco
VC135
Amanita vaginata
Perrito
N. I.: No Identificado por la población encuestada