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Facultad de Ciencia y Tecnología
cina para P. aeruginosa) a una concentración de 10 μg/ml. También se midieron los diámetros de las zonas de inhibición.
Resultados
Las semillas de A. muricata fueron sometidas a un proceso de extracción a pequeña escala, vía macera- ción, con tres diferentes disolventes orgánicos (Hex, CHCl3 y EtOH). Los extractos obtenidos se evaluaron para determinar su toxicidad para el crustáceo Artemia salina Leach (TAS). De manera general, un extracto o fracción se considera activo en este ensayo cuando presentan CL50 < 1000 μg/ml, mientras que para los compuestos puros se considera una CL50 < 200 μg/ml (McLaughlin, 1991), sin embargo, en el caso de las espe- cies de Anonáceas, la actividad se considera significa- tiva cuando las fracciones muestran CL50 <20 μg/ml (Ruenpprecht et al., 1990; Fang et al., 1993; Gu et al., 1995; Chávez y Mata, 1998a,b) Los resultados de la evaluación biológica se encuentran incluidos en la Tabla 1 y de ellos se desprende que el extracto más activo fue el adquirido con CHCl3, donde se obtuvo un CL50 <10 μg/ml, por lo que en seguida se realizó una extracción a gran escala con este disolvente, mientras que el de menor actividad fue el obtenido con hexano con una CL50 >1000 μg/ml, extracto que no fue incluido en la siguiente fase de la evaluación.
Tabla 1. Toxicidad para Artemia salina L. de los extractos y fracciones de Annona muricata
permitió confirmar que la fracción clorofórmica (AM-1) mantenía la actividad biológica, por lo que la fase acuosa fue descartada. Posteriormente, la fracción AM-1 se sometió a un segundo proceso de partición con una mezcla de Hex/MeOH. La evaluación biológica de las fracciones hexánica (AM-2) y metanólica (AM-3) permitió detectar que esta última concentraba la mayor actividad tóxica (Tabla 1), por lo que se procedió a separarla por cromatografía en columna abierta sobre gel de sílice. Este proceso permitió la obtención de cuatro grupos de fracciones secundarias, de las cuales sólo las identificadas como AM-3-II y AM-3-III resultaron activas. Sucesivas cromatografías en capa fina de estas fracciones permitieron el aislamiento de cuatro grupos de compuestos (AM-3-IIa y b y AM-3-IIIa y b), cuya actividad biológica aún no ha sido deter- minada. Cabe mencionar que, debido a la similitud de los factores de retención (Rf) de los compuestos que integran estos grupos, aún no ha sido posible su separación y purificación.
De manera adicional, se determinó, de forma cuali- tativa, el potencial antimicrobiano de las fracciones activas AM3-II y AM3-III, a través de la evaluación de su efecto sobre el crecimiento de especies de bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa), utili- zando un método de difusión en disco (Clark et al., 1981; Vander y Vlietinck, 1991; Gutiérrez et al., 1996). Los resultados de estas evaluaciones indican que únicamente la fracción AM3-III inhibió el crecimiento de S. aureus, se observaron halos de inhibición de 17, 19 y 21 mm, a las concentraciones de 10, 100 y 1000 μg/ml, respectivamente (Figura 3), correspon- dientes al 70, 80 y 90% de inhibición (Tabla 2), comparada con la inhibición del crecimiento que presentó esta cepa cuando fue incubada en presen- cia de ampicilina a una concentración de 10 μg/ml (control positivo).
Figura 3. Efecto de inhibición sobre el crecimiento de S. aureus de la fracción AM3-III
ab
cde
a. Control positivo de crecimiento; b. control de inhibición con anti- biótico (ampicilina 10 μg/ml); c-e. inhibición del crecimiento con 10, 100 y 1000 μg/ml de la fracción, respectivamente.
Extracto o fracción CL50 (μg/ml)
Exto. Hex (pequeña escala) Exto. CHCl3 (pequeña escala) Exto. EtOH (pequeña escala) AM-1 en CHCl3
AM-2 en hexano AM-3 en hexano AM3-I
AM3-II
AM3-III AM3-IV
> 1000 < 10 210 < 10 > 1000 57.4 > 1000 < 10 < 10 > 1000
El extracto clorofórmico se fraccionó de manera preliminar aplicando un método de partición con CHCl3/H2O, mediante el cual se obtuvieron las fraccio- nes AM-1, AM-2 y AM-3. La determinación de la TAS
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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004