Page 8 - InvUnivMult2004

Facultad de Ciencia y Tecnología
al desarrollo de nuevos agentes antitumorales y antimicrobianos de origen vegetal, que sean más eficaces y de menor toxicidad que los productos convencionales utilizados actualmente.
Metodología
Material vegetal. Las semillas de Annona muricata se obtuvieron a partir del fruto entero, el cual fue adquirido en el mercado de Mixcoac, México, D. F., en febrero del 2004. Las semillas se lavaron, se seca- ron a temperatura ambiente y se fragmentaron en una licuadora.
Extracción y fraccionamiento. Las semillas secas se extrajeron exhaustivamente por maceración a temperatura ambiente con Hex, CHCl3 y EtOH (10 g con cada disolvente), y con base en los resultados de la evaluación de la toxicidad para A. salina (TAS) de estos extractos (Tabla 1), se realizó una extrac- ción a gran escala con CHCl3 (concentración letal media, CL50 < 10 ppm), para lo cual se emplearon 450 g de semillas secas y pulverizadas. El proceso se llevó a cabo en dos ocasiones, utilizando un volu- men total de 2.5 L de CHCl3 y dejando entre cada maceración un periodo de 72 horas, al término de cada una de las cuales el extracto se filtró y se con- centró al vacío, al final se obtuvo un total de 4 g ex- tracto seco.
El extracto activo se fraccionó de manera preliminar mediante un proceso de partición con una mezcla de CHCl3-H2O (1:1). La fracción clorofórmica activa AM-1 (3.2 g, TAS CL50 < 10 μg/ml), utilizando una mezcla de Hexano-MeOH (1:1). El ensayo de TAS indicó que la fracción metanólica (AM-3) concen- traba la actividad biológica (CL50 < 10 ppm). La cromatografía en columna abierta de esta fracción (2.2 g), utilizando gel de sílice (60 g) y un gradiente de Hex/AcOEt/MeOH, permitió la obtención de 35 fracciones de 30 ml cada una, combinándose con aquellas que presentaron características cromato- gráficas similares. Como resultado de este proceso se generaron cuatro grupos de fracciones secunda- rias, identificadas como AM3-I (Hex/AcOEt 1:1); AM3-II (AcOEt 100%); AM3-III (AcOEt/MeOH 95:5), y AM3-IV (AcOEt/MeOH 1:1), de las cuales AM3-II y AM3-III resultaron activas biológicamente (CL50 < 10 μg/ml). La separación de los constituyentes de estas fraccio- nes se llevó a cabo mediante CCF preparativa sobre gel de sílice utilizando Hex/AcOEt (6:4) y CHCl3/MeOH
(9:1), respectivamente. Este último procedimiento permitió obtener cuatro grupos de constituyentes (AM3-IIa, AM3-IIb, AM3-IIIa y AM3-IIIb).
Ensayos biológicos
Determinación de la toxicidad para el crustáceo Artemia salina Leach (TAS). El potencial citotóxico de los extractos, fracciones y grupos de compuestos se determinó mediante la evaluación de su toxicidad para el crustáceo Artemia salina Leach (McLaughlin, 1991; Anderson, Gotees y McLaughlin, 1991; Meyer et al., 1982). Los extractos se consideraron activos cuando presentaron CL50 menores a 1000 μg/ml, mien- tras que para las fracciones se tomaron en cuenta valores menores a 20 μg/ml (Anderson et al., 1991; McLaughlin, 1991). La selección del bioensayo se rea- lizó considerando que en repetidas ocasiones se ha encontrado una magnífica correlación entre la pre- sencia de acetogeninas citotóxicas y la toxicidad de- mostrada frente al crustáceo por los extractos crudos obtenidos a partir de distintas especies de anoná- ceas (Rupprecht, Hui, McLaughlin, 1990; Fang et al., 1993; Gu et al., 1995). De manera adicional, el ensayo es simple, rápido y económico (Meyer et al., 1982; McLaughlin, 1991; Anderson et al., 1991).
Determinación de la actividad antimicrobiana. Los microorganismos utilizados para el presente estudio se obtuvieron en el cepario de Microbiología Médica de la Universidad Simón Bolívar: Pseudomo- nas aeruginosa y Staphylococcus aureus, los cuales fueron cultivados en medio sólido de infusión cerebro-corazón (medio BHI de BIOXON).
El potencial antimicrobiano de las fracciones activas AM3-II y AM3-III fueron evaluados de forma cualita- tiva utilizando el ensayo de difusión en disco (Gutié- rrez et al., 1996; Vander y Vlietinck, 1991; Clark, El y Li, 1981). Los discos de papel de 12 mm de diámetro se impregnaron con 100 μl de las disoluciones de cada fracción para obtener concentraciones de 10, 100 y 1000 μg/ml por disco y se dejaron secar a temperatura ambiente. Las placas de medio se sembraron por du- plicado y se inocularon con 106 bacterias/ml, pos- teriormente se colocaron tres discos con una misma concentración en forma equidistante y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Para cada microorganismo se preparó un control positivo de crecimiento y un control de inhibición microbiana con el antibiótico de referencia: (ampicilina para S. aureus y gentami-
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 3, No3, DICIEMBRE 2004 9