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(Saussure, 1857) obtenidos comercialmente, los cua- les se mantuvieron en peceras con agua corriente a una temperatura de 20 a 22 °C, alimentados con peces pequeños.
Obtención y cuantificación de proteínas: para llevar a cabo la obtención y cuantificación de proteínas, a los acociles se les inyectó al hemo- cele (entre la cabeza y el tórax) 100 ml de solu- ción salina al 0.9% con los inhibidores de PGS (Npx y Dexa 100 mg / ml). La HL fue obtenida por perfusión (30 minutos post-inoculación). A las muestras se les agregaron 10 ml de un mezcla de inhibidores de proteasas (TLCK 10 mM; TPCK 10 mM y o-fenantrolina 50 mM) posteriormente se incubaron en una temperatura de 60 °C durante 10 minutos, a continuación se separó la fase acuosa por centrifugación a 13000 rpm / 5min y se tomó el empastillado, el cual se resuspendió en 40 ml ual de amortiguador de muestra 2X. La pastilla se guardó a -20 °C para cuantificación y ensayos; la cuantificación se realizó por el método de Bra- dford (Smith, 1989).
Separación de Proteínas: las muestras de proteínas fueron analizadas por medio de electroforesis en geles de acrilamida (PAGE-SDS) al 10% (pH 8.8), preparados según métodos estándar (Smith, 1989). Posteriormente el gel se colocó en una cámara de electroforesis agregándole amortiguador de corrida (0.025 M de Tris- glicina 0.192 M pH 8.3, SDS 0.1%). La electroforesis se realizó a 40 – 60V y a temperatura ambiente durante 16 horas. Des- pués se tiñó el gel con azul de Coomassie (Smith, 1989).
Medición Espectrofotométrica de la actividad de la proFO: para determinar por un método colori- métrico la actividad de la FO se tomaron 20 ml de la HL, se colocaron en pozos de una multiplaca para ELISA de 96 posiciones, se les agregaron 20 ml de PBS 1X (pH de 7.4), y 10 ml de Laminarina (1 mg / ml; componente de pared celular de levaduras). Posteriormente se les agregó L-dihidroxifenilala- nina (L-Dopa) (4 mg / ml en amortiguador PBS 1X), se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos en oscuridad, se observaron los resulta- dos y se midieron las densidades ópticas a 570 nm (Lanz, 1993).
Los experimentos se hicieron por triplicado y se les aplicó la prueba estadística de Kruskal-Walis
para evaluar si existieron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos.
Resultados
Análisis de la actividad de proFO en HL de C. montezumae y efecto de los inhibidores: en un ensayo in vitro la HL de C. montezumae se puso en contacto con laminarina, compuesto de la pared de hongos que en otros artrópodos se ha descrito que es capaz de iniciar la cascada de la FO y en presencia de L-DOPA, el cual de manera natural esta presente en la HL y es oxidado y polimeriza- do por acción de la FO generando el compuesto colorido melanina y se observó la formación de un precipitado negro que indicó la funcionalidad del sistema. Cuando la L-DOPA se sustituyó por el ácido carmínico, pigmento presente en la HL del homóptero Dactylopius coccus, también se observó la formación de color, indicando que este sustrato, el cual es el que utiliza este insecto durante sus reacciones de melanización, también es utilizable por el sistema de FO de C. montezu- mae (figura 1a).
Figura 1a. Ensayo espectofotométrico in vitro de la actividad de proFO de la HL de C. montezumae
La HL fue incubada con diferentes sustratos (L-Dopa y carmín) durante 10 minutos; posteriormente se trató con un componente patógeno (laminarina) durante 30 minutos. a) A1: HL de acocil; pozo control. A2: HL + Laminarina + L-Dopa (sustrato). A3: HL + Laminarina+ Carmín (sustrato). A4: HL + npx + Laminarina + L-Dopa (sustrato) A5 : HL + npx + Laminarina + Carmín. A6: HL + L-Dopa (sustrato). A7: HL + npx + L-Dopa (sustrato). En los pozos A2 a A7 se observa melanización.
Cuando se añadieron al sistema los inhibidores dexa y npx aún hubo actividad de melanización in vitro (figura 1b).
Facultad de Ciencia y tecnología
A1 HL Control
A2 HL Control + Laminarina + L-Dopa A3 HL Control + Laminarina + Carmín A4 HL npx + Laminarina + L-Dopa
A5 HL npx + Laminarina + Carmín
A6 HL Control + L-Dopa
A7 HL npx + L-Dopa
Pozos
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
InvEstIgaCIón UnIvErsItarIa MUltIDIsCIplInarIa - año 5, no5, DICIEMbrE 2006 9