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Facultad de Ciencia y Tecnología
Introducción
Los inmunoensayos han tenido éxito por décadas en los laboratorios clínicos dado que son tecnologías analíticas de una extraordinaria efectividad. Su uso se expandió para aplicarlos en diversas áreas de investigación, incluyendo la fisiología vegetal (Tchorbadjieva, Kalmukova, Pantchev y Kuyurkchiev, 2005; Fehér, Pasternak y Dudits, 2003; Toonen, Schmidt, Hendriks, Verhoeven, VanKammen y De Vries, 1996) con resultados igualmente positivos. En esta disciplina, se presenta el inconveniente que se trabaja con moléculas que no son antígenos conocidos y por lo tanto, las casas comerciales no producen los anticuerpos contra éstos. Por lo que se establece la necesidad de elaborarlos, para su uso como reactivos de diagnóstico.
Producir anticuerpos policlonales en un animal de experimentación inmunocompetente para moléculas antigénicas es posible y relativamente sencillo. Sin embargo, cuando se trata de moléculas pequeñas y con una pobre inmunogenicidad, denominadas haptenos, la producción se ve limitada o nula. Éste es el caso de los reguladores de crecimiento vegetal, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y kinetina (kin), compuestos centrales en el presente trabajo. Para resolver esta situación, se elaboran conjugados, que consisten en unir los haptenos a proteínas acarrea- doras. Las proteínas se emplean dado que son muy inmunogénicas y las más comunes son ovoalbúmina (OVA) y albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas del inglés Bovine Serum Albumine).
Para la obtención de conjugados hapteno-acarredor es necesario exponer grupos funcionales en ambas moléculas por medio de solventes adecuados para posteriormente unirlos. La construcción resultante, hereda la propiedad inmunogénica de la proteína y es posible estimular al sistema inmune de un animal in- munocompetente para la obtener anticuerpos contra el hapteno en cuestión. La proporción de anticuerpos generados con el hapteno es mayor, en comparación con los obtenidos para el conjugado y para la misma proteína acarreadora (Rojas-Espinosa, 2006).
Los reguladores de crecimiento vegetal son com- puestos determinantes en la morfogénesis vegetal. Conocer su modo de acción y las células blanco implicaría manipular eficientemente los cultivos in vitro vegetales, impactando positivamente su productividad. Existen varias estrategias experimen- tales para investigar lo anterior, incluyendo técnicas
moleculares, por el análisis de ácidos nucleicos y los inmunoensayos. Éstos últimos son sensibles, de bajo costo y útiles para indagar el funcionamiento celular. La razón es que los resultados que generan son informativos y concluyentes, no dan pie a con- fusiones como los que se obtienen por medio del análisis de los ácidos nucleicos. Para analizar células vegetales no se cuenta con alguno de forma comer- cial, por lo que en el presente trabajo se produjeron anticuerpos policlonales para dos reguladores de crecimiento vegetal de tipo auxina (2,4-D) y citoci- nina (kinetina), ambos determinantes para generar respuestas morfogénicas en plantas.
Objetivo
Producir conjugados hapteno–acarredor con el áci- do 2,4-diclorofenoxiacético y kinetina con albúmina sérica bovina para producir anticuerpos policlonales en conejos.
Método
Se elaboraron dos conjugados hapteno-acarreador con los reguladores de crecimiento vegetal 2,4-D y kinetina acoplados a la proteína BSA. Se siguió el procedimiento de Yakovleva, Zeravik, Michurai, Formanovsky, Franek y Eremin (2003), con ligeros cambios, para el conjugado con kinetina. Y se mo- dificó el procedimiento para producir el conjugado con 2,4-D por los resultados obtenidos con el mé- todo de Knopp (2004).
Síntesis del conjugado Kin-BSA. Se disolvieron 0.2 mmol de kinetina en 1 ml de dimetilformamida. Esta solución se agregó, gota a gota, a otra de 0.2 mmol de glutaraldehído al 25% (p/v) con 0.9 ml de agua destilada. La mezcla de reacción se agitó sua- vemente por 10 min. Después, se adicionó 2 μmol de BSA disuelta en 10 ml de solución amortiguadora de carbonatos (0.01 M de hidrocarbonato de sodio, pH 9.6) y se homogenizó por 15 min a temperatura ambiente. Para inhibir las bases de Schiff, mediante suefectoácido-base, seincorporaron200μmolde tetraborato de sodio. La reacción se incubó por 3 h, a temperatura ambiente, en agitación suave. Poste- riormente, el producto se dializó en una membrana con límite de exclusión molecular de 10 kDa contra 3 L de PBS (10 mM de solución amortiguadora de
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No 12, ENERO - DICIEMBRE 2013
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