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Facultad de Ciencia y Tecnología
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INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 12, No12, ENERO - DICIEMBRE 2013
fosfatos con 0.8% p/v de NaCl, pH 7) 1X (cuatro cambios de la solución), a 4 °C. El precipitado resultante se recuperó por centrifugación a 3 500 rpm durante 10 min. Se almacenó a temperatura de refrigeración, es decir, a 4° C. Se manipuló todas las veces en condiciones de esterilidad.
Síntesis del conjugado 2,4-D-BSA. Se disolvieron 0.2 mmol de 2,4-D en 6 ml de dioxano. A la mezcla se le agregó 1 ml de glutaraldehído al 2.5% (p/v) en una concentración de 0.2 mmol. Se mezcló suavemente por 10 min a temperatura ambiente. Se agregaron 4 μmol de BSA en 20 ml de solución amortiguadora de carbo- natos (0.01 M de carbonato de sodio, pH 9.6) y se mezcló por 3 h con 200 μmol de tetraborato de sodio. El producto se dializó contra PBS 1X con 5 recambios en una membrana con límite de exclusión molecular de 12 kDa. El precipitado se recuperó por centrifugación a 3 500 rpm por 10 min. Se almacenó a 4 °C y se manipuló siempre bajo condiciones de esterilidad.
Caracterización de los conjugados. Se hizo por titulación de los grupos amino libres con el ácido 2,4,6 trinitrobencenosulfónico (TNBS, Hermanson, 2005).
Se disolvieron 2.4 mg/ml de cada conjugado en NaOH al 1 N. Para 0.3 ml de la solución del conjugado se le agregaron un volumen de HCl al 1 N, 1.4 ml de solución de bicarbonato de sodio al 4% a pH 8.5 y 1 ml de solución acuosa de TNBS al 0.1%. Se mezcló y se incubó por 2 h a 40 °C. Posteriormente, se incorporó 1 ml de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 0.5 ml de HCL al 1 N. Se mezcló y se leyó la absorbancia a 335 nm. El número de grupos amino libres (n) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
n = (DE MWprot)/(eNH2 Cprot)
donde DE es la diferencia de extinción entre el conjugado y la muestra de referencia, MWprot es el peso mole- cular de la proteína, Cprot es la concentración molar de la proteína y eNH2 es el coeficiente de extinción molar de un grupo amino libre de la proteína acarreadora.
Inmunización de conejos y obtención de sueros hiperinmunes. Para la inmunización de los conejos hembra de la cepa New Zealand de 2.5 kg con kinetina-BSA, se hizo intradérmicamente con 1 ml de la solu- ción inmunogénica en dosis crecientes, de 0.3 a 1.2 mg, del conjugado disuelto en PBS con 1 volumen igual de adyuvante completo de Freund. Las inoculaciones se hicieron en el lomo de los conejos, en múltiples sitios. La estimulación se hizo por 5 semanas en intervalos de 7 días. Posteriormente, se hicieron inoculaciones intra- musculares por intervalos de 7 días por 3 meses con 1 mg del inmunógeno disuelto en PBS y con un volumen de adyuvante incompleto de Freund (Yakovleva et. al., 2003). Terminado el protocolo de inmunización, se sangraron a los conejos en blanco y se obtuvo el suero. Los sueros obtenidos se almacenaron bajo condiciones estériles, en alícuotas a -18 °C hasta su uso.
La inmunización de los conejos hembra de la cepa New Zealand de 2.5 kg con 2,4-D-BSA fue hecha intradérmi- camente en múltiples sitios. Se inoculó 0.1 ml de conjugado que se preparó con 2 mg de éste, disuelto en 1 ml de solución salina fisiológica estéril y se emulsificó con 1 mL de adyuvante completo de Freund. La estimulación se hizo cada semana durante 8 semanas. A la semana 4, se preparó el antígeno con adyuvante incompleto de Freund. Terminado el protocolo de inmunización y después de 7 o 10 días, se sangró en blanco a los conejos por punción cardiaca. Por último, se obtuvo el suero y se almacenó bajo condiciones estériles, en alícuotas a -18 °C hasta su uso.
Evaluación de la calidad de los antisueros. Durante el curso de las inmunizaciones, se evaluaron la canti- dad (título que corresponde a la dilución del antisuero) y cualidad (especificidad, afinidad y sensibilidad hacia diferentes antígenos) de los anticuerpos generados por ambos conjugados. Se sangraron los conejos por la arteria central de la oreja y se analizaron los antisueros por las técnicas de precipitación en capilar y doble difusión de Oüchterlony (Margi, 2004).
En la precipitación en capilar, se hicieron diluciones seriadas con un factor de 2 de los conjugados en pro- porción de 0.05 mg/ml en solución salina fisiológica. Se llenaron capilares en partes iguales de la solución del conjugado y del antisuero. Se incubaron por 24 h a temperatura ambiente. El título del antisuero fue la dilución más alta en la que aún se observó precipitado.