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Facultad de Ciencia y Tecnología
30 min. a 5oC y centrifugó durante 20 min. a 13,000 xg. La muestra se separó en sobrenadante y en residuo de harina. Al residuo se le agregó 200 mL Na2SO4 al 5% y mezcló durante 30 min. El primer sobrenadante se precipitó con (NH4)2SO4 al 50, 70 y 100% de satu- ración y centrifugado (20 min. a 13,000 xg) en cada nivel. El precipitado de proteína formado se dializó con agua durante 24 horas, con cuatro cambios de agua desionizada y se centrifugó (20 min. a 13,000 xg).
Hidrólisis enzimática
La hidrólisis enzimática de las proteínas del grano de frijol se llevaron a cabo utilizando el método de Surovset y cols. (2001), utilizando alcalasa (Sigma- Aldrich St. Louis, Mo., USA) como enzima proteolitica, a una concentración de 2.4 mUA/mL, esta enzima es una serinproteasa de Bacillus lincheniformis con actividad endopeptidasa (actividad específica de 2.4 UA/g). Para llevar a cabo la hidrólisis con tripsina se utilizó tripsina de páncreas bovino (Sigma-Aldrich St. Louis, Mo., USA; 10600 unidades BAEE/mg solido) en una relación 1:62.5.
Determinación del grado de hidrólisis
El grado de hidrólisis (GH) fue determinado por cuan- tificación de los grupos amino libres, de acuerdo con el método descrito por Adler-Nissen (1979). Un mL del búfer de fosfatos 0.5 M, pH 8.2 y 1 mL de una solución de ácido 2,4,6 trinitrobenzen-sulfónico en agua (1 mg/mL) fue adicionado a 125 mL de los hidrolizados proteínicos, para los distintos tiempos de hidrólisis (15 a 90 min). La mezcla de reacción se incubó durante 1 h a 50 °C en obscuridad debido a que la luz acelera la reacción. La reacción se detuvo mediante la adición de 2 mL de HCl 0.1 N, la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 30 min; la absorbencia se leyó a 340 nm. El blanco se preparó de la misma manera. GH se calculó de la siguiente manera:
%GH = (h/htot) x 100
donde, (h) enlaces peptídicos cortados/(htot) enlaces peptídicos totales por unidad de peso. Utilizando L-Leucina como estándar. El análisis fue corrido por triplicado.
Determinación de la actividad inhibitoria de la DPP-IV
La actividad de la enzima DPP-IV (D7052; Sigma–Al- drich; St. Louis, MO, USA, de riñón de cerdo) se deter- minó por un método espectrofotométrico. Utilizando
como sustrato Gly-Pro-pNA (G0513 de Sigma–Aldrich; St. Louis, MO, USA). Para esto se utilizaron micro- placas de 96 pocillos midiendo el incremento en la absorbencia a 405 nm con un lector de ELISA (Bio Tek m QUANT; Bio Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA.). La actividad enzimática se determinó utilizando una concentración final de 0.1 mM de Gly-Pro-pNA en búfer 100 mM de Tris, pH 8.0 (búfer A) a 37°C (Kojima, Ham y Kato, 1980). Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1 mmol p- nitroanilina por min bajo las condiciones del ensayo.
Para calcular los mmol p-nitroanilina se procedió a realizar una curva patrón de p-nitroanilina (N2128 de Sigma–Aldrich; St. Louis, MO, USA) bajo las mismas condiciones del ensayo. Los hidrolizados liofilizados se disolvieron en el búfer A. La disolución del hidro- lizado (50 mL) se mezclaron con 100 mL de 1.0 mM Gly-Pro-p-nitroanilida (contenida en el búfer A). La mezcla de reacción fue incubada a 37 °C por 20 min, seguido por la adición de 50 mL de DPP-IV (diluida en bufer A; obteniendo 4 mU de concentración final). La mezcla reacción se monitoreó durante 15 min y los datos registrados se presentaron frente al tiempo y la actividad de la DPP-IV se cuantificó a partir de la parte lineal de la curva. La mezcla de reacción se detuvo adicionando 100 mL de un búfer 1 M de acetato de sodio (pH 4.0). El porcentaje de inhibición se determi- nó en relación a la velocidad obtenida sin fracciones peptídicas. Los valores de concentración inhibitoria media-máxima (IC50) se calcularon representando gráficamente el logaritmo de la concentración del hidrolizado (mg/mL) frente a la actividad inhibitoria de la DPP-IV (%).
Cromatografía de exclusión molecular
La caracterización de los hidrolizados por exclusión molecular se realizó utilizando una columna (1.4 x 29 cm) empacada con Sephadex G-15 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), utilizando un búfer de corrida como el descrito por Konishi, Fumita, Ikeda, Okuno y Fuwa (1985): 32.5 mM K2HPO4–2.6 mM KH2PO4 (pH 7.5), 0.4 M NaCl, 20 mM b-mercaptoetanol, G = 0.5 (búfer A). La columna fue previamente equilibrada con el búfer A. Los hidrolizados proteínicos liofilizados fueron disueltos en el búfer A, se colocaron 500 mL de la muestra a un flujo constante de 0.3 mL/min, las fracciones fueron colectadas a temperatura ambiente y leídas a 214 nm. Se utilizó un marcador de ultra bajo peso molecular (M3546: triosa fosfato isomerasa 26.6 kDa; mioglobina 17 kDa; a-lactoalbúmina 14.2 kDa; aprotinina 6.5 kDa; insulina 3.5 kDa y bradiquinina 1.06 kDa. Sigma–Aldrich, St. Louis, Mo., USA).
INVESTIGACIÓN UNIVERSITARIA MULTIDISCIPLINARIA - AÑO 14, No 14, ENERO - DICIEMBRE 2015
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